胰酶使用注意及貼壁細胞的消化

胰酶使用注意：

1、在使用胰酶細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。

2、胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板后生長狀況會較差。

貼壁細胞的消化：

1、吸去培養液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清

2、加入少量胰酶細胞消化液，略蓋過細胞即可，根據胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細胞消化時間有所不同）

3、顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養器皿底部發現細胞的形態發生明顯的變化呈白茫狀；或者用槍吹打細胞發現細胞剛好可以被吹打下來。

4、此時吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的細胞培養液，吹打下細胞，即可直接用于后續實驗如果發現消化不足，則加入胰酶細胞消化液重新消化。

如果發現細胞消化時間過長，未及吹打細胞，細胞已經有部分直接從培養器皿底部脫落，直接用胰酶細胞培養液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后，加入含血清的培養液重新懸浮細胞，即可用于后續實驗。

常用的細胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使細胞間的蛋白質（如細胞外基質）水解，改變細胞間的連接，使組織或細胞片分散成單個細胞，制成細胞懸液用于進一步的實驗。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液，視細胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養器皿的大小而定），以使充分浸潤；

一般消化時間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細胞單層連接成片）轉為透明、點狀（出現細小空隙）時，棄去細胞消化液，或看見培養瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的培養液終止消化，吹打分散；如見大量細胞片狀脫落，已消化過頭，則不能頃倒消化液而直接進行下一步操作。（消化過頭，可造成大量細胞從瓶壁上脫下，甚至造成細胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，所以加入培養基可以終止反應。

胰酶配置方法：

1、培養液配制，方便好用，對細胞影響小，并且培養液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解

2、生理鹽水配制，要先調ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時，調pH 7.8-8.0，過濾除菌。）

3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：稱取胰酶粉末0.1g，先用少許滅菌過的PBS調成糊狀，然后補足到100ml。置室溫攪拌4小時或冰箱內過夜，過濾滅菌，分裝，4℃保存備用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調成糊狀，然后再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，并不斷攪拌振蕩；2.次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存備用，常用濃度為0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右。）

一般0.45微米的一次性濾器過濾除菌，至于作用效果，需要消化一次細胞感覺一下，因為不同廠家的酶不一樣，有的作用溫和，有的作用劇烈。

4、是否需要四度放置過夜，取決于你的胰酶的純度。過去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要四度過夜. 而現在的胰酶純度都很高，就沒有必要四度過夜。從理論上來說，四度放置過夜，給細菌生長的機會，盡管過濾可以出去細菌，可是出不掉其代謝產物。

胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因，考慮有：

1、過期或是酶已經部分變性

2、溶液ph值不對

3、在沒過濾之前的絮狀沉淀是正常現象，因胰酶多取自動物胰腺，沉淀為組織塊，過濾后即可